1、60℃常規(guī)脫蠟至水后，將石蠟切片先后浸入二甲本苯Ⅰ，二甲本苯Ⅱ各10min。然后逐級降濃度酒精入水，每次3-5min。
2、熱修復(fù)抗原：將切片置于0.01mol/LpH6.0枸櫞鈉緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10min后，反復(fù)1-2次，置于室溫自然冷卻。0.01mol/LpH6.0的PBS洗滌3次，每次5min
3、消除內(nèi)源性過氧化物酶：用3%H2O2室溫孵育5-10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗滌2-3次，每次5min；
4、滴加一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗到切片上，37℃孵育1小時左右或者4℃過夜，pH7.4的PBS洗滌3次，每次5min。一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間。
5、加入廣譜二抗，37℃孵育1小時，取出后PBS洗滌3次，每次5min。
6、DAB顯色：取DAB顯色液I及II各50微升加至入1mL的水中，配成DAB工作液，滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。蒸餾水充分洗滌以終止反應(yīng)。
7、觀察顯色后自來水沖，蘇木目精復(fù)染1-2min，，自來水沖10min，梯度酒精脫水，二甲本苯透明，中性樹膠封片，干燥，分析拍照。
