熒光是指一種光致發光的冷發光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光照射，吸收光能后進入激發態，并且立即退激發并發出比入射光的波長長的出射光。
PCR-熒光探針法利用熒光的原理，當光照射到某些原子時，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態躍遷到第一激發單線態或第二激發單線態等。第一激發單線態或第二激發單線態等是不穩定的，所以會恢復基態，當電子由第一激發單線態恢復到基態時，能量會以光的形式釋放，產生熒光。
PCR-熒光探針法的交探針模式(Beacon)：分子信標是一種呈發夾結構的莖環寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發后產生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標的莖環結構中，環一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下，因為模板不存在時形成莖環結構，當加熱變性會互補配對的莖環雙鏈解開，如果有模板存在環序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，因淬滅作用被解除，發出激發光子。由于是酶切作用的存在，分子信標也是積累熒光。
PCR-熒光探針法的雙雜交探針模式(FRET)：FRET探針又稱雙雜交探針，FRET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針端標記FAM熒光基團，另一探針端標記Red640熒光基團。當復性時，探針結合在模板上，FAM基團和Red640基團相鄰，激發FAM產生的熒光，作為Red640基團的激發光被吸收，使Red640發出波長為640的熒光。當變性時，探針游離，兩基團距離遠，不能產生640波長的熒光。由于FRET探針是靠近發光，所以檢測信號是實時信號，非累積信號。
