闡述pcr核酸檢測試劑盒建立的理論模式和工作原理

　　1、什么是定量PCR？

　　以參照物為標準，對PCR終產物進行分析或對PCR過程進行監測，從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴增的指數期進行的。

　　2、定量PCR定量的理論依據是什么？

　　特定的待擴增基因片段起始含量越大，則指數擴增過程越短，當擴增速率趨于穩定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，終擴增片段的含量通常是一樣的。

　　理想的擴增結果：Y=X×2n其中Y代表擴增產物量，X代表PCR反應體中的原始模板數n為擴增次數；理論上PCR擴增效率為*，PCR產物隨著循環的進行成指數增長，但實際上：DNA的每一次復制都不*，即每一次擴增中，模板不是呈2的倍增長；實際應為：Y=X(1+E)n，其中E代表擴增效率：E=參與復制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1～105拷貝、循環次數n≤30時，E相對穩定，原始模板以相對固定的指數形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數期；隨著循環次數n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數形式增加，后進入平臺期。

　　3、熒光定量PCR定量的理論模式又是什么？

　　PCR是對原始待測模板核酸的一個擴增過程，任何干擾PCR指數擴增的因素都會影響擴增產物的量，使得PCR擴增終產物的數量與原始模板數量之間沒有一個固定的比例關系，通過檢測擴增終產物很難對原始模板進行準確定量。近年來研究人員通過大量的實踐，研究了相對準確的定量PCR方法，即熒光定量PCR。

　　PCR擴增通式：①Tn=T0（1+E）n

　　②Tn=Tn-1（1+E）n注：[0

　　其中E表示擴增效率，n為循環數，Tn表示在n個周期后PCR產物的數量，Tn-1表示在n-1個周期后PCR產物的數量，T0為原始模板數量。設定PCR到達指數擴增期時，產生一定的熒光(熒光依賴于某一循環擴增產物的總量，即特定的拷貝數K，為常數，大約在1010左右)高于背景為儀器所識別，此時的循環數為CP（crossingpoint）,也就是K=T0（1+E）CP，取對數即：

　　lgK=lgT0+CP*lg(1+E)

　　CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)

　　pcr核酸檢測試劑盒的成分產品組成：DNA提取液2、CTPCR反應液、HS-Taqplus酶、UNG、CT陰性對照、CT臨界陽性對照、CT強陽性對照。產品有效期：貯存于-20℃，有效期12個月。附件：注冊產品標準，產品說明書。

　　適應癥該產品用于對人尿道、生zhi道分泌物拭子樣本中的沙眼衣原體核酸DNA的檢測

　　PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時,探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。

　　pcr核酸檢測試劑盒的檢驗原理：pcr核酸檢測試劑盒從人血清或血漿中提取丙型肝炎病毒核酸（HCVRNA），通過RT-PCR一步法反應，利用特異性引物對HCVRNA進行體外擴增，在體系中采用Taqman-MGB探針法并結合非競爭性內標技術來定量檢測人血清或血漿中丙型肝炎病毒核酸（HCVRNA）的數量。可用于臨床對丙型肝炎的輔助診斷和抗病毒yao物的療效觀察。