熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題及解答
一、無(wú) Ct 值（信號(hào)）出現(xiàn)：
1.反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)；
2.檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般采用 72℃延伸時(shí)采集熒光，Taqman 方法則一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號(hào)；
3.引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性；
4.探針設(shè)計(jì)不佳：設(shè)計(jì)探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸；
5.模板量少：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的zui高濃度做起；
6.模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入以及模板反復(fù)凍融的情況發(fā)生。
二、如何確認(rèn)模板中是否含有 PCR 反應(yīng)阻害物質(zhì)：
有時(shí)RNA或cDNA模板中存在對(duì)反轉(zhuǎn)錄和熒光PCR 反應(yīng)的阻害物質(zhì)。為了確認(rèn)這樣的阻害物質(zhì)的有無(wú)，我們可以使用高濃度的模板按 3－4 個(gè)梯度稀釋?zhuān)⑹褂闷溥M(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。如果無(wú)阻害物質(zhì)存在，得到的 Ct 值就會(huì)依模板濃度的變化而變化；而如果模板中有阻害物質(zhì)的存在，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們就會(huì)發(fā)現(xiàn)高濃度的模板有反應(yīng)性能下降的現(xiàn)象。
三、Ct值出現(xiàn)過(guò)晚：
1.反應(yīng)條件不佳：未*反應(yīng)條件，可重新設(shè)計(jì)引物或探針，適當(dāng)降低退火溫度，增加鎂離子濃度等；
2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠；
3.擴(kuò)增產(chǎn)物片段過(guò)長(zhǎng)：一般采用 100－200bp 的擴(kuò)增長(zhǎng)度。
四、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系不佳：
1.加樣存在誤差，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不呈梯度；
2.標(biāo)準(zhǔn)品降解：標(biāo)準(zhǔn)品盡量避免反復(fù)凍融；
3.引物或探針不佳：重新設(shè)計(jì)；
4.模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高。
五、陰性對(duì)照液出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增：
1.熒光 PCR mix 或水被污染；
2.引物二聚體的出現(xiàn)：在 35 循環(huán)后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合溶解曲線(xiàn)進(jìn)行分析；
3.反應(yīng)過(guò)程中探針降解：用PAGE電泳對(duì)探針進(jìn)行檢測(cè)。
六、溶解曲線(xiàn)不止一個(gè)主峰：
1.引物設(shè)計(jì)不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；
2.引物濃度不佳：適當(dāng)調(diào)整引物濃度；
3.退火溫度低：提高退火溫度；
4.鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度；
5.模板中有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組 DNA 的污染，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。
七、如何避免熒光定量PCR中基因組DNA擴(kuò)增：
1.引物設(shè)計(jì)時(shí)避免基因組DNA擴(kuò)增；
2.在RNA提取過(guò)程中使用DNaseⅠ處理去除RNA中混有的基因組DNA。
熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題及解答
八、擴(kuò)增效率低：
1.反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解；
2.反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法；
3.反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋?zhuān)偌尤氲襟w系中，減少抑制物的影響。
九、重復(fù)性不好：
1.加樣不準(zhǔn)確；
2.儀器在樣品上溫度條件有差異，溫度均一性不好；
3.模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。
十、擴(kuò)增曲線(xiàn)不正常，剛進(jìn)入指數(shù)期就很快進(jìn)入平臺(tái)期并向右下彎曲：
1.基線(xiàn)等設(shè)置不當(dāng)：按儀器說(shuō)明書(shū)重新操作；
2.模板量過(guò)多：當(dāng)擴(kuò)增曲線(xiàn)在10個(gè)循環(huán)內(nèi)起峰時(shí)，應(yīng)將模板稀釋100－1000倍后使用。
十一、各孔間的熒光信號(hào)如何進(jìn)行校正：
由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過(guò)在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱(chēng)為陽(yáng)性參比信號(hào)。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異。
十二、熒光定量PCRCT值一般在多少后認(rèn)為模板沒(méi)擴(kuò)增：
當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35時(shí)，Real Time RT-PCR檢測(cè)無(wú)效，基因沒(méi)有表達(dá)；當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)的循環(huán)數(shù)在 32-35 個(gè)循環(huán)時(shí)，需要有至少 3 個(gè)重復(fù)才能判斷是否能檢測(cè)到基因的表達(dá)。
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